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      熱門詞:生物顯微鏡 水質分析儀 微波消解 熒光定量PCR 電化學工作站 生物安全柜

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      原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒(Protein A/G親和抗體)12598ES04
      原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒(Protein A/G親和抗體)12598ES04
      • 原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒(Protein A/G親和抗體)12598ES04

      原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒(Protein A/G親和抗體)12598ES04

      產品報價:2855元

      更新時間:2021/9/15 17:30:53

      地:上海

      牌:YEASEN

      號:12598ES04

      廠商性質: 生產型,貿易型,服務型,

      公司名稱: 翌圣生物科技(上海)股份有限公司

      產品關鍵詞: Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA   Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA   高通量測序平臺  

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      (聯系我時,請說明是在來寶網上看到的,謝謝?。?/b>


      產品信息

       

      產品名稱

      產品編號

      規格

      價格/元

      Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?

      原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒(Protein A/G親和抗體)

      12598ES04

      4 T

      2855

      12598ES12

      12 T  

      7855

      12598ES48

      48 T

      28655


      產品描述

       

      Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?是針對Illumina?高通量測序平臺專門研發的用于原位靶蛋白DNA結合圖譜測序文庫轉座酶法構建試劑盒,適用于100-1,000,000個細胞起始量的樣本建庫,也提供了應用于單細胞的可能性。相較于傳統的ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&Tag,本試劑盒優化了反應和建庫流程,具有文庫構建時間更短(僅需7小時)、操作更簡單、對起始樣本要求更低、抗體投入量更少、文庫產量更高等優點。經過細胞捕獲、一抗孵育、二抗孵育、轉座酶孵育、轉座酶激活、摻入DNA標準品、細胞裂解、磁珠回收gDNA、文庫擴增和磁珠分選,靶蛋白結合的DNA片段最終轉化為適用于Illumina?平臺測序的文庫。

      試劑盒包含兩個獨立模塊,BOX-I的核心為結合細胞的ConA磁珠和回收DNA的磁珠。BOX-II包含細胞透化劑,蛋白酶抑制劑,抗體結合buffer,轉座酶結合buffer,蛋白酶K以及后續文庫擴增所需的所有試劑。此外,本試劑盒已在不同種類細胞的驗證(如293、K562、CHO、ESC細胞等),均具有良好的建庫效率和建庫產量。提供的所有試劑都經過嚴格的質量控制和功能驗證,程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

       

      產品組分

       

      產品組分后的表格.png

      *測序時 Index 序列 N501-TAGATCGC,N701-TAAGGCGA。

       

      運輸與保存方法

       

      冰袋運輸。效期一年。存儲溫度如下,切不可搞錯!

      Box I:2-8保存;Box II:-20保存。

       

      注意事項

       

      一、 關于操作

      1. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

      2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。

      3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

      4. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染,進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離;配備文庫構建專用移液器等設備;定時對各實驗區域進行清潔(推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM核酸去除噴霧),以保證實驗環境的潔凈度。

      5. 操作細胞應盡量輕柔以保持細胞活性。

      6. 本產品僅用作科研用途!

      二、 應用范圍

      本試劑盒適用于動物細胞的靶蛋白DNA結合圖譜研究,針對的細胞投入量為100-100,000個,動植物組織和真菌等材料經過特殊處理也可以使用本試劑盒進行相關實驗,也提供了應用于單細胞的可能性。

      三、 ConA beads操作注意事項

      1. 使用前將磁珠平衡至室溫,請勿將磁珠置于0℃以下存放。

      2. ConA beads與細胞結合后,應避免劇烈震蕩或用力吹打磁珠-細胞復合物使細胞應力損傷與磁珠分離。

      3. 高細胞投入量(超過50萬細胞)在長時間孵育過程中出現部分磁珠聚集為正?,F象,以輕彈管底或輕輕吹打使磁珠重懸。

      4. 在處理磁珠溶液時應盡量避免高轉速離心或長時間置于磁力架上,人為造成磁珠凝集。

      5. 避免磁珠長時間暴露在空氣中使得磁珠干裂或者磁珠-細胞復合物損傷(不超過3 min。

      6. 本產品僅用作科研用途!

      四、關于DNA Selection Beads純化與分選DNA

      1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠,我們推薦使用Hieff NGS? DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)AMPure? XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

      2. 磁珠使用前應先平衡至室溫,否則會導致得率下降、分選效果不佳。

      3. 請勿將磁珠置于0℃以下存放。

      4. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

      5. 轉移上清時,請勿吸取磁珠,即使微量殘留都將影響后續文庫質量。

      6. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現用現配,否則將影響回收效率。

      7. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應;過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下,室溫干燥3 min足以讓磁珠充分干燥。

      8. DNA純化或長度分選產物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脫,產物于4°C可保存2天,-20°C可保存1個月。

      五、關于試劑

      1. 不同的Buffer試劑應注意保存條件,避免失效。

      2. Digitonin有細胞毒性,且容易降解。在溶液配制過程中請做好個人防護。加入Digitonin的溶液應現配現用,在4度放置不超過2天。

      六、文庫結構

      文庫結構后的序列.png

      七、關于二抗的選擇

      Hieff NGS? A-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?( Yeasen Cat#12597)試劑盒提供的是Protein A與轉座酶融合的轉座子復合物, Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?(Yeasen Cat#12598)提供的是Protein A/G與轉座酶融合的轉座子復合物。這兩個試劑盒可以直接用于CUT&Tag實驗;實驗中使用二抗,請根據二抗種屬來源與Protein A或者Protein A/G的親和能力進行選擇,可以參照以下表格:

      物種

      抗體亞型

      Protein A(Cat#12597)

      Protein A/G(Cat#12598)

      Human

      Total IgG

      +++++

      +++++

      IgG1

      +++++

      +++++

      IgG2

      +++++

      +++++

      IgG3

      ++

      +++++

      IgG4

      +++++

      +++++

      IgM

      ++

      ++

      IgA1

      ++

      ++

      IgA2

      ++

      ++

      Mouse

      Total IgG

      +++++

      +++++

      IgM

      -

      -

      IgG1

      ++

      ++++

      IgG2a

      +++++

      +++++

      IgG2b

      +++++

      +++++

      IgG3

      +++++

      +++++

      Rat

      Total IgG

      ++

      ++++

      IgG1

      +

      +++

      IgG2a

      -

      +++++

      IgG2b

      -

      +++

      IgG2c

      +++++

      +++++

      IgG3

      ++

      ++++

      Rabbit

      Total IgG

      +++++

      +++++

      Goat

      Total IgG

      ++

      +++++

      Sheep

      Total IgG

      ++

      +++++

      Guinea pig

      Total IgG

      +++++

      +++++

      Hamster

      Total IgG

      ++

      +++

      Donkey

      Total IgG

      +++

      +++++

      Pig

      Total IgG

      +++++

      +++++

      Dog

      Total IgG

      +++++

      +++++

      Cat

      Total IgG

      +++++

      +++++

      Cow

      Total IgG

      ++

      +++++

      Horse

      Total IgG

      ++

      +++++

      Monkey

      Total IgG

      +++++

      +++++

      【注】:+++++代表親和能力非常強,+++代表親和能力中等,+代表親合能力很弱,-代表沒有親合能力。

      1630980046942781.png   

      八、關于文庫擴增

      1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司高保真DNA聚合酶所組成,大大增強了擴增的均一性,即使是低拷貝的基因,也能進行無偏好性地擴增。

      2. 推薦使用本公司的Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina? (96 Index) (Yeasen Cat#12610)模塊進行文庫擴增,該模塊提供了96種不同組合的雙端index文庫制備引物,程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

      3. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足,將導致文庫產量低;循環數過多,又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2和表3列舉了在293細胞中,使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb一抗(Cell Signaling Technology Cat#9733)或Histone H3K4me3 antibody (pAb)一抗(Active Motif Cat# B_2615077)和Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961)和本試劑盒進行文庫擴增,細胞投入量與相應擴增循環數的推薦。

      2.細胞投入量與擴增循環數推薦表(H3K27me3)*

      細胞投入量

      PCR循環數

      文庫產量

      1,000,000

      10

      700 ng

      100,000

      13

      700 ng

      10,000

      16

      500 ng

      1,000

      20

      500 ng

      100

      24

      500 ng

      3. 細胞投入量與擴增循環數推薦表(H3K4me3)*

      細胞投入量

      PCR循環數

      文庫產量

      1,000,000

      10

      500 ng

      100,000

      13

      500 ng

      10,000

      17

      500 ng

      1,000

      21

      500 ng

      100

      25

      500 ng

      【注】:*由于不同靶蛋白的表達量、DNA結合能力差異較大。實驗中需根據建庫起始細胞量、蛋白類型、細胞類型和樣本處理情況適當調整擴增循環數。推薦在PCR之前使用qPCR的方法對轉座酶插入的片段進行初步定量判斷再決定循環數。

      九、關于DNA標準品

       DNA spike-in mix(5 pg/uL)是來源于大腸桿菌 Lambda DNA的三段序列,長度分別為230bp、250bp和300bp,摩爾濃度比約為1:3:10(見圖1)。標準品主要用于在不同處理條件下或者不同細胞狀態下對測序數據進行標準化,有利于對測序數據進行定量分析,每10萬投入量細胞加入1uL即可,也可根據靶蛋白的結合DNA能力和豐度自行調整。標準品序列:

      一些序列加圖.png

      十、關于文庫質檢

      1. 通常情況下,構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

      2. 文庫濃度檢測可使用:基于雙鏈DNA熒光染料的方法,如Qubit?、PicoGreen?等;基于qPCR定量的方法。

      3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測:Qubit?等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時,無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物及其他不完整雙鏈結構產物;qPCR定量基于PCR擴增原理,僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(即可測序的文庫),可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

      4. 文庫長度分布檢測,可通過Qsep、Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

      十一、自備材料

      1. 抗體:靶蛋白的一抗和相對應的二抗。

      2. 文庫質檢:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產品;文庫定量試劑。

      3. 其他材料:無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

      4.  Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina? (96 Index)(Cat#12610)或其他替代引物。

       

      使用方法

       

      一、細胞準備

      1. 在室溫條件下收集細胞并計數,死亡的細胞染色質松散,暴露出大量的裸DNA,轉座酶復合物隨機切割會造成比較強的噪音信號,建議樣本細胞活性不低于80% (細胞活性可以用臺盼藍染色來鑒定)。

      2. 貼壁較緊的細胞如Hela細胞等可用Accutase或者Trypsin部分消化獲得。

      3. 植物或真菌細胞可通過特殊處理獲得原生質體或細胞核進行實驗,方法可參考附錄四。

      4. 新鮮或者凍存的動物組織可通過特殊處理獲得細胞懸液進行實驗,方法可參考附錄四附錄五。

      二、操作流程


      圖2.png

      2. 原位DNA結合圖譜測序建庫試劑盒原理示意圖和操作流程

      三、操作步驟

      3.1 溶液配制(0.5 h)

      1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢復到室溫后,顛倒10次后瞬離。

      2. BF1900 μL Cell wash buffer中加入μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。標為Cell wash buffer(-),混勻后瞬離。

      3. BF2:250 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入2.5 μL 5% Digitonin。標記為Cell wash buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      4. BF3:400 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。標記為Tag buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      5. BF4:提前配制含一抗的 Wash buffer(+):取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+),加入1 μL 50×x Protein blocker,和0.5 μL 一抗(按說明書推薦免疫熒光IF抗體使用濃度,對照抗體用IgG),混勻后瞬離,儲存在室溫。(對照組可以用加IgG或不加一抗的BF4

      3.2 細胞捕獲(0.5 h)

      1. 細胞準備:在室溫下收獲細胞并計數,取100-1,000,000個細胞,室溫,600×x g離心3 min,吸除上清。加入140 μL BF1-Cell wash buffer(-),輕輕吹打重懸;室溫,600×x g離心3 min,吸除上清;加入90 μBF1-Cell wash buffer(-),輕輕吹打重懸,轉移至PCR管中。(:對于大小不同的細胞,請根據實際情況調整離心力)

      2. 磁珠活化:顛倒或輕輕旋渦振蕩混勻Con A珠漿(4T小包裝磁珠體積較小,可以瞬離后用移液槍吹吸10次混勻),對于每個約100-1,000,000個細胞的樣品,取10 μL Con A磁珠于已預加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁,吸除管內全部溶液;取下EP管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁;吸除管內全部溶液,取下EP管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混合。

      3. 活化后的磁珠與細胞結合:將重懸在ConA bind buffer中的珠漿輕輕滴加在細胞懸液中,顛倒5次混勻后,將PCR管置于旋轉儀上混勻5-10 min。

      3.3 結合一抗,二抗和轉座酶(2.5 h)

      :結合細胞后的磁珠需要輕柔操作,避免劇烈渦旋或用尖口移液槍頭反復吹吸導致細胞損傷,建議顛倒、輕輕渦旋、輕彈底部或者用平口槍頭輕輕吹吸等方式混勻,避免產生大量氣泡,避免磁珠在磁力架上放置過長時間和直接暴露在空氣中時間過長(不超過3 min造成磁珠結塊及細胞破裂)。

      1. 將與細胞結合好的磁珠取下,瞬離(< 100x ×g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min);吸去PCR管中全部液體;加入50 μL BF4-含一抗的 Wash buffer(+),輕輕渦旋或輕彈底部混勻(對照組可以用加IgG或不加一抗的BF4)。

      2. 室溫下旋轉孵育2 h或者4 °C旋轉孵育過夜。水平旋轉,保證液體在管底。每隔30 min可輕彈底部混勻,避免磁珠聚集干結。

      3. 將與一抗結合好的磁珠取下,瞬離(< 100×gxg),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min)。吸去PCR管中全部液體。

      4. 加入49.5 μL BF2-Cell wash buffer (+)后,再加入0.5 μL二抗(1:100稀釋), 輕輕渦旋或輕彈底部混勻。(若樣品較多,二抗結合液可一起提前配制)

      5. 室溫下旋轉孵育0.5 h-1 h。水平旋轉,保證液體在管底。每隔30 min輕彈底部或者輕輕渦旋混勻,避免磁珠聚集干結。

      6. a. 將與二抗結合好的磁珠取下,瞬離(< 100×gxg),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min)。吸去PCR管中全部液體。加入65 μL BF2-Cell wash buffer (+),輕輕顛倒或渦旋離心管10次,充分分離磁珠及細胞。

      b. 瞬離(< 100×g)x g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min),吸去PCR管中全部液體。再加入65 μL BF2-Cell wash buffer (+),輕輕顛倒或渦旋離心管10次,充分分離磁珠及細胞。

      一共清洗磁珠兩次

      7. 將磁珠瞬離(<100×gx g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min),吸去PCR管中全部液體。

      8. 加入49 μL BF3-Tag buffer(+)后,再加入1 μL pA/G-Transposome Mix。輕輕渦旋或輕彈底部混勻。(若樣品較多,Transposome結合液可一起提前配制)

      :不同的實驗環境,轉座酶的切割活性可能不同,請根據實際情況,在此基礎上調整轉座酶的使用濃度。本試劑盒中轉座酶復合物的濃度為2.5 μM)。

      9. 室溫下旋轉孵育1 h。水平旋轉,保證液體在管底。每隔30 min輕彈底部混勻或者輕輕渦旋,避免磁珠聚集干結。

      (【:轉座酶孵育可能會導致輕微的磁珠板結。孵育太久(超過3 h)會造成轉座酶非特異性結合到DNA上,增強了背景噪音)。

      10. a. 瞬離(<100×x g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min),吸去PCR管中全部液體。加入100 μL BF3-Tag buffer(+),輕輕顛倒或渦旋離心管10次,充分分離磁珠及細胞。

      b. 瞬離(<100×xg g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min),吸去PCR管中全部液體。加入100 μL BF3-Tag buffer(+),輕輕顛倒或渦旋離心管10次,充分分離磁珠及細胞。

      c. 瞬離(<100×x g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min),吸去PCR管中全部液體。加入100 μL BF3-Tag buffer(+),輕輕顛倒或渦旋離心管10次,充分分離磁珠及細胞。

      一共清洗磁珠3次。

      3.4 轉座酶激活(1 h)

      1. 將磁珠瞬離(<100×x g),靜置于磁力架至磁珠貼壁(不超過2 min)。吸去PCR管中全部液體。加入 30 μL BF3-Tag buffer(+)后,再加入μL 30×x Activating buffer。輕輕渦旋或輕彈底部混勻。(若樣品較多,激活緩沖液可一起提前配制)

      2. 37 °C旋轉孵育1 h。水平旋轉,保證液體在管底。每隔30 min輕彈底部混勻,避免磁珠聚集干結。

      3.5 蛋白酶K消化和基因組DNA回收(1 h)

      1. 向每個樣品中加入2 μL 15×x Terminate Solution、μL DNA Spike-in mixμL 30×x Proteinase K(此時磁珠會板結)(若樣品較多,可一起提前配制)。全速轉速渦旋樣品約10 sec,混勻后瞬離,將樣品置于PCR儀,在55 oC消化30 min (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜。

      2. 短暫離心(<100×x g),將離心管置于磁力架上靜置3 min,取30 μL上清。

      DNA Spike-in mix主要用于不同處理條件或者細胞狀態下的測序數據標準化和定量分析,為非必需加入的組分??蛻艨筛鶕嶒炐枰袛嗍欠窦尤?/span>DNA Spike-in mix。10萬投入量細胞加入1 uL即可,也可根據靶蛋白的結合DNA能力和豐度自行調整。具體請參見注意事項。)

      3. 加入40 μL室溫下平衡的DNA Selection Beads,渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置孵育5 min。

      4. 短暫離心(<100×x g),將離心管置于磁力架上靜置3 min,待磁珠完全貼壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始終處于磁力架中,從另一側加入200 μL 80%乙醇,避免直接沖刷磁珠,靜置30-60 s。吸除液體,保持PCR管始終處于磁力架中,再次加入200 μL 80%乙醇,靜置30-60 s。吸除干凈液體,保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過3 min)。從磁力架上取下PCR管,加入21 μL ddH2O,并充分渦旋。室溫靜置5 min。

      5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5 min),小心轉移20 μL上清至干凈的管中,于-20℃保存。

      3.6 文庫擴增

      1. 將表4中試劑解凍后顛倒混勻,置于冰上備用。

      2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應。

      4. PCR擴增反應

      名稱

      體積(μL)

      步驟三純化產物

      20

      PCR Primer Mix

      3

      N5XX*

      1

      N7XX*

      1

      2×Ultima Amplification Mix

      25

      ddH2O

      Up to 50 μL

      *Hieff NGS? Tagment Index Kit for Illumina(96 Index)Cat#12610ES96)中提供8種N5XX和12種N7XX,可根據樣品數量和Index選擇策略自行選擇。

      3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,并短暫離心將反應液收集至管底。

      4. 將PCR管置于PCR儀中,設置表5所示反應程序,進行PCR擴增。

      5. PCR擴增反應程序

      表5.png

      【注】*此步不可省略。轉座反應產物并非完整的雙鏈DNA,72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

      **由于不同靶蛋白的表達量、DNA結合能力差異較大。實驗中需根據建庫起始細胞量、蛋白類型、細胞類型和樣本處理情況適當調整擴增循

      環數。推薦在PCR之前使用qPCR的方法對轉座酶插入的片段進行初步定量判斷再決定循環數。組蛋白修飾作為靶蛋白所使用的PCR循環數

      可參考表2和表3。

      3.7 文庫純化

      1. 將平衡至室溫的DNA Selection Beads磁珠,振蕩或上下顛倒混勻。加入60 μL(1.2×x室溫下平衡的DNA Selection Beads,渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置孵育5 min。

      2. 短暫離心(<100×x g),將離心管置于磁力架上靜置3 min,待磁珠完全貼壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始終處于磁力架中,從另一側加入200 μL 80%乙醇,避免直接沖刷磁珠,靜置30-60 s。吸除液體,保持PCR管始終處于磁力架中,再次加入200 μL 80%乙醇,靜置30-60 s。吸除干凈液體,保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過3 min)。從磁力架上取下PCR管,加入21 μL ddH2O,并充分渦旋。室溫靜置5 min。

      3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5 min),小心轉移20 μL上清至干凈的管中,于-20℃保存。此外,如需獲得長度分布更集中的文庫擴增產物,可使用膠回收方式進行長度分選和純化;如對文庫長度分布范圍等無特殊要求,擴增產物也可不進行長度分選,直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化。文庫大小可使用Agilent 2100 Bioanalyzer、Qsep或者凝膠電泳進行檢測。

      3.8 文庫分選(根據靶蛋白抗體選擇)

      1. 由于抗體的結合效率、不同靶蛋白在染色質上結合區域的差異以及不同種類細胞的染色質狀態差異,文庫大小可能存在不同模式的分布。我們推薦一種磁珠分選的方法,可以有效去掉文庫中的,使得文庫大小主峰約520bp左右,即兩個核小體保護DNA長度的插入片段??蛻艨筛鶕ê玫奈膸齑笮∽孕袥Q定是否需要進行磁珠分選。

      2. 進行雙輪分選時,需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補齊至100 μL,加入60 μL (0.6×x)室溫下平衡的DNA Selection Beads,渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置孵育5 min。

      3. 短暫離心(<100×x g),將PCR管置于磁力架上靜置5 min,待溶液澄清后,小心轉移上清到干凈的離心管中(殘留3-5 μL,避免吸到磁珠)。加入50 μL (0.5×x)室溫下平衡的DNA Selection Beads,渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,室溫靜置孵育5 min。

      4. 短暫離心(<100×x g),將離心管置于磁力架上靜置3 min,待磁珠完全貼壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始終處于磁力架中,從另一側加入200 μL 80%乙醇,避免直接沖刷磁珠,靜置30-60 s。吸除液體,保持PCR管始終處于磁力架中,再次加入200 μL 80%乙醇,靜置30-60 s。吸除干凈液體,保持PCR管始終處于磁力架中,開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂(不超過3 min)。從磁力架上取下PCR管,加入21 μL ddH2O,并充分渦旋。室溫靜置5 min。

      5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5 min),小心轉移20 μL上清至干凈的管中,于-20℃保存。此外,如需獲得長度分布更集中的文庫擴增產物,可使用膠回收方式進行長度分選和純化;如對文庫長度分布范圍等無特殊要求,擴增產物也可不進行長度分選,直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化。

      3.9 文庫質量控制

      通常情況下,構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價,具體請參見注意事項。

      附錄

      一、組蛋白修飾H3K27me3和H3K4me3 DNA結合圖譜建庫

      分布使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb(Cell Signaling Technology Cat#9733)、Histone H3K4me3 antibody (pAb)(Active Motif Cat# B_2615077)和Normal Rabbit IgG(Cell Signaling Technology Cat#2729)作為一抗、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作為二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961)。使用Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?100-1,000,000個293細胞投入量樣本建庫,并分別使用1.2×磁珠進行純化,再使用0.6×x, 0.4×x磁珠分選,文庫大小結果使用Qsep和2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。


      李3.jpg

      3. Qsep和瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質量分析


      二、不同細胞投入量的
      H3K27me3 DNA結合圖譜建庫測序

      使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb作為一抗(Cell Signaling Technology Cat#9733)、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作為二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961)。使用Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?100-1,000,000個293細胞投入量樣本建庫,并分別使用1.2×磁珠進行純化,結果使用Qsep進行檢測。文庫測序后與ENCODE中的H3K27me3 ChIP-seq數據進行比較。

      圖4.png

      4. Qsep對不同細胞投入量文庫質量分析

      圖5.png

      5.利用本試劑盒鑒定不同細胞投入量條件下H3K27me3在染色質上的信號分布和相關性

      三、不同細胞投入量的H3K4me3 DNA結合圖譜建庫測序

      使用Histone H3K4me3 antibody (pAb)作為一抗(Active Motif Cat# B_2615077)、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作為二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961)。使用Hieff NGS? G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina?100-1,000,000個293細胞投入量樣本建庫,并分別使用1.2×磁珠進行純化,結果使用Qsep進行檢測。文庫測序后與ENCODE中的H3K4me3 ChIP-seq數據進行比較。

      圖6.png

      6.  Qsep對不同細胞投入量文庫質量分析

      圖7.png

      7. 利用本試劑盒鑒定不同細胞投入量條件下H3K4me3在染色質上的信號分布和相關性

      四、 植物組織細胞核的分離。

      3.1 溶液配制(0.5 h)

      1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢復到室溫后,顛倒10次后瞬離。

      2. BF1:900 μL Cell wash buffer中加入μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。標為Cell wash buffer(-),混勻后瞬離。

      3. BF2:250 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入2.5 μL 5% Digitonin。標記為Cell wash buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      4. BF3:400 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。標記為Tag buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      5. BF4:提前配制含一抗的 Wash buffer(+):取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+),加入1 μL 50×x Protein blocker,和0.5 μL 一抗(按說明書推薦免疫熒光IF抗體使用濃度,對照抗體用IgG),混勻后瞬離,儲存在室溫。

      6. 核提取液緩沖液A10 mM Tris pH 8.0, 10 mM KCl, 0.5 mM spermidine。

      7. 核提取液緩沖液B10 mM Tris pH 8.0, 10 mM KCl, 0.5 mM spermidine, 0.5% Triton X-100, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

      8. 核提取液緩沖液C10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, 0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

      3.2 植物細胞核分離和捕獲(1 h)

      1. 為避免葉綠體或線粒體等細胞器DNA產生的數據背景,我們建議對植物組織進行細胞核提取處理。稱取0.2 g新鮮植物組織(如葉片等),加入液氮充分碾磨成凍干粉末。將碾磨好的粉末使用6 mL預冷的核提取液緩沖液A懸浮并轉移至15 ml離心管中,顛倒震蕩混勻。

      2. 使用100-200目篩網對細胞核懸液進行過濾處理(若起始材料較少,可以不經過此操作步驟)。

      3. 使用平口或者剪刀剪平的移液槍頭將細胞核懸液分裝至1.5 mL離心管中,每管1 mL。600×xg g,4℃離心5 min,去掉上清。

      4. 加入1 mL預冷的核提取液緩沖液B重懸沉淀后,600×g,4℃離心5 min,去掉上清。

      5. 加入1 mL核提取液緩沖液C輕輕震蕩重懸沉淀后,600×g,4℃離心5 min,去掉上清。重復三次后。將細胞核重懸于90 ul核提取液緩沖液C中。

      6. 磁珠活化步驟:10 μL Con A磁珠于已預加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁,吸除管內全部溶液;取下EP管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁;吸除管內全部溶液,取下EP管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混合。

      7. 磁珠與細胞核結合:將重懸在ConA bind buffer中的珠漿輕輕滴加在細胞核懸液中,顛倒5次混勻后,將PCR管置于旋轉儀上混勻5-10 min。

      按照3.3開始進行實驗(不需要進行3.2步驟)。

      五、 動物組織細胞的分離。

      3.1 溶液配制(0.5 h)

      1. 提前10 min取出ConA bind buffer 、Cell wash buffer 、Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢復到室溫后,顛倒10次后瞬離。

      2. BF1:900 μL Cell wash buffer中加入μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) 。標為Cell wash buffer(-),混勻后瞬離。

      3. BF2:250 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入2.5 μL 5% Digitonin。標記為Cell wash buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      4. BF3:400 μL BF1-Cell wash buffer(-),加入0.8 μL 5% Digitonin和20 μL 3M NaCl。標記為Tag buffer(+),混勻后瞬離。儲存在室溫,若過夜則儲存在4℃,使用前提前10 min取出恢復至室溫。

      5. BF4:提前配制含一抗的 Wash buffer(+):取48.5 μL BF2-Cell wash buffer (+),加入1 μL 50×x Protein blocker,和0.5 μL 一抗(按說明書推薦免疫熒光IF抗體使用濃度,對照抗體用IgG),混勻后瞬離,儲存在室溫。

      6. 細胞緩沖液A20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine。

      3.2 動物細胞分離和捕獲(1 h)

      1. 稱取0.2 g新鮮動物組織(黃豆粒大?。?,加入液氮充分碾磨成凍干粉末。將碾磨好的粉末使用6 mL細胞緩沖液A懸浮并轉移至15 mL離心管中,顛倒震蕩混勻。

      2. 使用100-200目篩網對細胞懸液進行過濾處理(若起始材料較少,可以不經過此操作步驟)。

      3. 使用平口或者剪刀剪平的移液槍頭將細胞核懸液分裝至1.5 ml離心管中,每管1 mL。600×x g,4℃離心5 min,去掉上清。

      4. 加入140 μL BF1-Cell wash buffer(-),輕輕吹打重懸;室溫,600×x g離心3 min,吸除上清;加入90 μBF1-Cell wash buffer(-),輕輕吹打重懸,轉移至PCR管中。(:對于大小不同的細胞,請根據實際情況調整離心力)

      5. 磁珠活化步驟:10 μL Con A磁珠于已預加40 μL ConA bind buffer的PCR管中吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁,吸除管內全部溶液;取下EP管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混合,靜置于磁力架至磁珠貼壁;吸除管內全部溶液,取下EP管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混合。

      6. 磁珠與細胞結合:將重懸在ConA bind buffer中的珠漿輕輕滴加在細胞懸液中,顛倒5次混勻后,將PCR管置于旋轉儀上混勻5-10 min。

      按照3.3開始進行實驗(不需要進行3.2步驟)。

       

      HB210906




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